Каспази апоптоз. Апоптоз та його значення. Вітамін Д – найважливіший компонент, що посилює запуск апоптозних механізмів у пухлини

(від др.-греч απόπτωσις - Опадіння, листопад) - найбільш поширений тип запрограмованої клітинної смерті. Іншими словами - це сукупність клітинних процесів, що призводять до загибелі клітини. На відміну від іншого виду клітинної смерті некрозу при апоптозі не відбувається руйнування цитоплазматичної клітинної мембрани і, відповідно, вміст клітини не потрапляє в позаклітинне середовище. Характерною ознакою є фрагментація ДНК у міжнуклеосомальних ділянках специфічною ендонуклезою – CAD (caspase activated DNase) на фрагменти з розміром, кратним 180–200 нуклеотидів. В результаті апоптозу відбувається утворення апоптичних тілець — мембранних везикул, що містять цілісні органели та фрагменти ядерного хроматину. Ці тільця поглинаються сусідніми клітинами чи макрофагами внаслідок фагоцитозу. Так як позаклітинний матрикс не уражається клітинними ферментами, навіть за великої кількості апоптозних клітин, запалення не спостерігається.

Процес апоптозу необхідний для фізіологічного регулювання кількості клітин організму, для знищення старих клітин, для формування лімфоцитів, які не є реактивними до своїх антигенів (аутоантигенів), для осіннього опадіння листя рослин, для цитотоксичної дії Т-лімфоцитів кілерів, для ембріонального розвитку. шкірних перетинок між пальцями у ембріонів птахів) та інше.

Порушення нормального апоптозу клітин призводить до неконтрольованого розмноження клітини та появи пухлини.

Термін «апоптоз» був уперше вжитий 1972 р. Керром, Віллі та Керрі, які описали його як доповнюючий, але протилежний мітоз механізм регуляції популяції тварин клітин.

Значення апоптозу

Апоптоз – невід'ємна частина життєдіяльності більшості багатоклітинних організмів. Особливо важливу роль він відіграє у процесах розвитку. Наприклад кінцівки чотирилапих закладаються як лопатоподібні вирости, а формування пальців відбувається завдяки загибелі клітин між ними. Також підлягають апоптозу більше не потрібні клітини, таким чином зокрема руйнується хвіст у пуголовків під час метаморфозу. У нервовій тканині хребетних під час ембріонального розвитку більше половини нейронів гинуть шляхом апоптозу відразу після утворення.

Також апоптоз є частиною системи контролю за якістю клітин, він дозволяє руйнувати ті з них, які неправильно розташовані, пошкоджені, нефункціональні або потенційно небезпечні для організму. Прикладом можуть бути T- та B-лімфоцити, які гинуть, якщо не несуть корисних антиген-специфічних рецепторів або несуть аутореактивні. Шляхом апоптозу також вмирає більшість лімфоцитів атківованих при інфекції після її подолання.

У дорослих організмів одночасно регуляція проліферації клітин та апоптозу дозволяє підтримувати стали розміри цілої особини та її окремих органів. Наприклад, після застосування препарату фенобарбітал, що стимулює проліферацію гепатоцитів, у щурів збільшується печінка. Однак відразу після припинення дії цієї речовини всі зайві клітини підлягають апоптозу, внаслідок чого розмір печінки повертається до нормального.

Також апоптоз відбувається, коли клітина «відчуває» велику кількість внутрішніх ушкоджень, які вона не може репарувати. Наприклад, у разі пошкодження ДНК клітина може трансформуватися в ракову, щоб цього не сталося вона, за нормальних умов, «кінчає життя самогубством». Також гине шляхом апоптозу багато клітин інфікованих вірусами.

Маркери апоптичних клітин

Клітини, що гинуть шляхом апоптозу, можна розпізнати за низкою морфологічних ознак. Вони стають меншими і щільнішими (пікноз), округляються і втрачають псевдоподії, в них руйнується цитоскелет, розпадається ядерна мембрана, хроматин конденсується і фрагментується. На поверхні клітин з'являється велика кількість бульбашок, якщо клітини досить великі, вони розпадаються на оточені мембранами фрагменти — апоптичні тільця.

В апоптичних клітинах окрім морфологічних відбувається також велика кількість біохімічних змін. Зокрема, ДНК розрізається спеціальними нуклеазами в лінкерних ділянках між нуклеосомами на фрагменти рівної довжини. Тому при поділі всієї ДНК апоптичної клітини за допомогою електрофорезу можна спостерігати характерну «драбинку». Інший метод виявлення фрагментації ДНК – мічення її вільних кінців за допомогою методу TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase d U TP n ick e nd l abeling).

Зміни зазнає також плазматична мембрана апоптичних клітин. За нормальних умов негативно заряджений фосфоліпід фосфатидилсерин міститься лише у її внутрішньому (поверненому до цитозолю) шарі, проте під час апоптозу він «перескакує» у зовнішній листок. Ця молекула служить сигналом "з'їж мене" для ближніх фагоцитів. Фосфатидилсерин-індуковане поглинання апоптичних клітин, на відміну від інших типів фагоцитозу, не призводить до виділення медіаторів запалення. Описана зміна плазмалеми лежить в основі ще одного методу виявлення клітин, що гинуть шляхом апоптозу - фарбування анексином V, специфічно зв'язується з фосфатидилсеріном.

Під час загибелі клітин шляхом апоптозу вони також втрачають електричний потенціал, за нормальних умов існує на внутрішніх мембранах мітохондрій. Це явище можна використовувати для виявлення апоптичних клітин за допомогою позитивно заряджених флуоресцентних барвників, які в нормі накопичуються всередині мітохондрій завдяки негативному заряду на внутрішній поверхні їх внутрішніх мембран. Під час апоптозу рівень зафарбовування мітохондрій суттєво знижується. Маркер апоптозу також служить вивільнення цитохрому c з мітохондрій в цитозоль.

Каспази – медіатори апоптозу

Клітинні системи, що забезпечують проходження апоптозу, аналогічні в усіх тварин, центральне місце у яких займає сім'я білків каспази. Каспази - це протеази, що мають в активному центрі залишок цистеїну, і розрізають свої субстрати за специфічним залишком аспарагінової кислоти (звідси назва: cвід cysteineі aspвід aspartic acid).Каспази синтезуються в клітині у вигляді неактивних прокаспаз, які можуть ставати субстратами для інших, вже активованих каспаз, що ріжуть їх в одному або двох місцях залишку аспартату. Два утворені фрагменти - більший і менший - з'єднуються між собою, формуючи димер, що асоціює з таким димером. Сформований таким чином тетрамер і є активною протеазою може розрізати білки-субстрати. Крім ділянок, що відповідають більшій та меншій субодиницям, прокаспази іноді також містять інгібіторні продомени, які деградують після відщеплення.

Внаслідок розщеплення та активації одних каспази іншими формується протеалітичний каскад, який суттєво посилює сигнал та робить апоптоз з певного моменту незворотним процесом. Ті прокаспази, які починають цей каскад, називаються ініціаторним, а їхні субстрати — ефекторними. Після атківації ефекторні каспази можуть розщеплювати інші ефекторні прокаспази або білки-мішені. До машини ефекторних каспаз, що руйнуються при апоптозі, належать зокрема білки ядерної ламіни, розщелення яких призводить до розпаду цієї структури. Також деградує білок, при нормальних умовах пригнічує CAD ендонуклеази, внаслідок цього починається фрагментація ДНК. Розщеплюються каспазами та білки цитоскелету та міжклітинної адгезії, внаслідок чого апоптичні клітини округляються та від'єднуються від сусідніх клітин, і таким чином стають легше мішенню для фагоцитів.

Набір каспази, необхідний для проходження апоптозу, залежить від типу тканини та шляху, яким активується клітинна смерть. Наприклад, у мишей при «виключенні» гена, що кодує ефекторну каспазу-3, апоптоз не відбувається в мозку, проте нормально протікає в інших тканинах.

Гени прокаспаз активні у здорових клітинах, а отже білки необхідні для протікання апоптозу постійно присутні, потрібна лише їхня активація для запуску суїциду клітин. До складу ініціаторних прокаспазів входить довгий продомен, що містить CARD (caspase recruitment domain,домен залучення каспази). CARD дозволяє ініціаторним прокаспазам приєднуватися до адаптерних білків утворюючи активаційні комплекси, коли клітина отримує сигнал, що стимулює апоптоз. В активаційних комплексах кілька молекул прокаспаз опиняються у безпосередній близькості один одного, чого достатньо для їх переходу в активний стан, після чого вони розрізають одна одну.

Два краще вивчені сигнальні шляхи активації каскаду каспази в клітинах ссавців називаються зовнішнім і внутрішнім (мітохондріальним), кожен з них використовує власні ініціаторні прокаспази.

Шляхи активації апоптозу

Зовнішній шлях

Клітина може отримувати сигнал, що індукує апоптоз, ззовні, наприклад, від цитотоксичних лімфоцитів. У такому разі активується так званий зовнішній шлях (extrinsic pathway),що починається з рецепторів смерті. Рецептори смерті - це трансмембранні білки, що належать до сімейства рецепторів фактора некрозу пухлин (ФНП), наприклад, сам рецептор ФНП і рецептор смерті Fas. Вони формують гомотримери, у яких кожен мономер має позаклітинний ліганд-зв'язуючий домен, трансмембранний домен та цитоплазматичний домен смерті, через адаптерні білки залучає та активує прокаспази.

Ліганди рецепторів смерті також гомотримерами. Вони споріднені між собою і належать до сімейства сигнальних молекул фактора некрозу пухлин. Наприклад, цитотоксичні лімфоцити несуть на своїй поверхні ліганди Fas, які можуть приєднуватися до рецепторів смерті Fas на плазмалемі клітин-мішеней. У такому разі внутрішньоклітинні домени цих рецепторів з'єднуються з адаптерними білками. (FADD, Fas-associated death domain),а ті у свою чергу залучають ініціаторні прокаспази 8 та/або 10. В результаті цієї серії подій формується сигнальний комплекс, що індукує смерть, — DISC (Death inducing signaling complex).Після активації в цьому ініціаторному комплексі каспази розрізають ефекторні прокаспази і запускають апоптичний каскад.

Багато клітин синтезують молекули, певною мірою захищають їхню відмінність від активації зовнішнього шляху апоптозу. Прикладом такого захисту може бути експресія так званих рецепторів-приманок (Decoy receptors),які мають позаклітинні домени зв'язування лігандів, проте не цитоплазматичних доменів сметри, а отже, не можуть запускати апоптозу і конкурують із звичайними рецепторами смерті за ліганди. Клітини також можуть продукувати білки, що блокують зовнішній шлях апоптозу, наприклад FLIP, схожий структурою до прокаспаз 8 і 10, проте не протеалітичної активності. Він пригнічує зв'язування ініціаторних прокаспаз із комплексом DISC.

Внутрішній шлях

Апоптоз також може запускатися зсередини клітини, наприклад, у разі її травми, пошкодження ДНК, нестачі кисню, поживних речовин або позаклітинних сигналів виживання. У хребетних цей сигнальний шлях називається внутрішнім (intrinsic pathway)або мітохондріальним,Ключовою подією в ньому є вивільнення певних молекул з міжмембранного простору мітохондрій. До таких молекул зокрема належить цитохром c, що у звичайних умовах входить до електронно-транспортного ланцюга мітохондрій. Цитохром c синтезується мітохондрії і виходить з неї завдяки формуванню Мітохондріальний апоптоз-індукувальний канал (МАК) і виконує регуляторну роль до настання морфологічних змін, пов'язаних з апоптозом. Після виходу цитохрому с відбувається його зв'язування з адаптерним білком Apaf (apoptotic protease actiuating factor-l),викликаючи олігомеризацію останнього в колесоподібну семичленну структуру, яка називається Апоптосома. Апоптосома приваблює та активує ініціаторну прокаспазу-9, яка потім може активувати ініціаторну прокаспазу.

У деяких клітинах зовнішній шлях апоптозу повинен активувати внутрішній для того, щоб ефективно знищити клітину. Внутрішній шлях чітко регулюється білками сім'ї Bcl-2.

Регуляція внутрішньої дороги білками сім'ї Bcl-2

До сімейства Bcl-2 належать еволюційно-консервативні білки, головною функцією яких є регуляція вивільнення цитохрому c та інших молекул з міжмебранного простору мітохондрій. Серед них є про-апоптичні та анти-апоптичні молекули, які можуть взаємодіяти між собою в різних комбінаціях, пригнічуючи один одного, баланс між їхньою активністю та визначати долю клітини.

Зараз відомо близько 20 білків із цієї сім'ї, всі вони містять хоча б один із чотирьох альфа-спіральних доменів гомології Bcl2, званих BH1-4 (bcl2 homology).Антиапоптичні білки сім'ї Bcl2 містять усі чотири домени, до них відносяться сам Bcl-2, а також Bcl-X L, Bcl-w, Mcl-1 та A1. Проапоптичні білки поділяються на дві групи, члени першої з яких містять три BH-домени (BH1-3), зокрема Bak, Bax і Bok (останній експресується тільки в тканинах репродуктивних органів). Найбільш численною серед родини Bcl-2 є друга група проапоптичних білків, які містять лише домен BH3 (BH3-only), до неї відносяться Bim, Bid, Bad, Bik/Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa, Puma.

За нормальних умов (тобто коли клітина не проходить апоптозу) антиапоптичні білки, такі як Bcl-2 і Bcl-X L, зв'язуються з проапоптичними білками BH123 (Bax і Bak) і не дозволяють їм полімеризуватися у зовнішній мембрані мітохондрій утворюючи пори. В результаті дії певного апоптичного стимулу в клітині активуються або починають синтезуватися проапоптичні білки, що містять лише домен BH3. Вони в свою чергу пригнічують антиапоптичні білки, знімаючи їх пригнічуючий ефект на Bak і Bax, або безпосередньо взаємодіють з останніми і сприяють їх олігомеризації та утворенню пор. Внаслідок пермеабілізації зовнішньої мембрани до цитозолю потрапляє цитохром c, а також інші медіатори апоптозу, такі як AIF (англ. Apoptosis inducing factor).

Наприклад, при нестачі сигналів виживання в клітині за посередництвом MAP-кінази JNK активується експресія BH3 білка Bim, що запускає внутрішній шлях апоптозу. У разі пошкодження ДНК відбувається накопичення супресора пухлин p53, який стимулює транскрипцію генів, що кодують BH3 білки Puma та Noxa, які також забезпечують проходження апоптозу. Ще один BH3 білок - Bid забезпечує зв'язок між зовнішнім та внутрішнім шляхами апоптозу. Після активації рецепторів смерті і, як наслідок, каспази-8, остання розрізає Bid з утворенням усіченої форми tBid (truncated Bid), яка переміщається до мітохонрію, де пригнічує Bcl-2.

Відео на тему

Жовтень 25, 2017 Немає коментарів

Апоптоз кардіоміоцитів почали вивчати лише у ХХІ столітті. З науково-практичної погляду проблема апоптозу міокарда навіть у кінці ХХ століття ще привертала уваги дослідників. Справді, як можна було виявляти інтерес до цієї проблеми, якщо є абсурдним сам факт генетично запрограмованої загибелі незаповнюваних клітин життєво важливого органу. Більше того, донедавна існувала думка про те, що апоптотична смерть кардіоміоцитів в інтактному міокарді взагалі не виникає.

Однак, використання сучасних методів дослідження апоптозу однозначно свідчить про існування цього процесу в серці. Наразі отримано статистично достовірні науково-практичні дані про те, що одним із провідних механізмів, відповідальних за зниження кількості життєздатних кардіоміоцитів за певних функціональних станів міокарда, є саме їх програмована загибель.

Насамперед, це стосується хронічної серцевої недостатності. Для цієї форми патології характерне перманентне прогресуюче зниження скорочувальної здатності лівого шлуночка. Одна із сучасних робочих гіпотез, що пояснюють патогенез хронічної серцевої недостатності, передбачає участь у її патогенезі апоптотичної загибелі кардіоміоцитів. Підставою для такої гіпотези стали відомості про наявність у зразках ексцентрично гіпертрофованого міокарда великої кількості кардіоміоцитів, що містять деградовану ДНК.

Такі ж ушкодження, але в меншому масштабі було виявлено і у зразках концентрично гіпертрофованого міокарда. Оскільки гіпертрофія лівого шлуночка спочатку розвивається за концентричним, а потім ексцентричним типом, виявлені відмінності в пошкодженні ДНК пояснювали стадійністю розвитку серцевої недостатності. Ексцентрична гіпертрофія - це пізніше і, отже, більш виражене явище, як і знаходило свій відбиток у більшої інтенсивності ушкодження ДНК.

На підставі таких фактів можна було б припускати існування прямої залежності між вираженістю серцевої недостатності та кількістю загиблих кардіоміоцитів. Однак дослідникам спочатку не вдалося виявити повноцінну картину апоптозної деградації клітин (у тому числі -ядер кардіоміоцитів) при електронній мікроскопії вивчених зразків. Ймовірно, «класичну» апоптотичну деградацію клітин спостерігали рідко та/або відбувалася швидкоплинно.

Зазвичай апоптозні тільця – фрагменти загиблої клітини зникають безвісти в середньому за 90 хвилин. Вони фагоцитуються макрофагами чи сусідніми клітинами без розвитку запальної реакції. Морфологічно реєстрований процес апоптозу триває 1-3 години.

Останнім часом апоптоз привертає до себе увагу кардіологів як потенційний патогенетичний фактор не тільки прогресуючої хронічної серцевої недостатності, а й багатьох інших форм патології серцево-судинної системи: коронарного атеросклерозу, інфаркту міокарда, великовогнищевого постінфарктного кардіосклерозу, кардіосклерозу. Для вивчення участі апоптозу у загибелі кардіоміоцитів досліджують серця померлих від кардіоваскулярних форм патології. Крім того, широко вивчають індукований апоптоз кардіоміоцитів у експериментальних тварин (щурів, кролів, собак) в умовах моделювання таких форм патології.

Перш ніж аналізувати участь апотозу в загибелі кардіоміоцитів, розглянемо сучасні уявлення про апоптоз. В даний час вважають, що апоптоз - це поліетиологічний процес, тому що індукується різноманітними факторами і, водночас, він очевидно монопатогенетичний, тобто в цілому розвивається за єдиним сценарієм незалежно від характеру причини, що його викликала. Поліетіологічність та монопатогенетичність - це основні критерії будь-якого типового патологічного процесу. Апоптоз є еволюційно виробленим процесом, тобто. за своєю суттю захисно-пристосувальним. Всі такі процеси можуть набувати патогенного характеру в певних, конкретних умовах їх виникнення та розвитку. Біологічно активні речовини, що у регуляції апоптозу, зазвичай, є білками, які синтез контролюють відповідні гени.

До генів, стимулюючих апоптоз, відносять гени р53, Вах, Bcl-xS. Разом з тим, відомі гени, що програмують синтез білків – інгібіторів апоптозу (Bcl-2, Ced-9, MCL-1 – induced Myeloid Leukemia Cell differentiation protein; MCL-1 – це той самий білок, який називають «фактором виживання», так як він продовжує термін життя клітин). Найбільш яскравими та інформативними білками, що відображають проліферативні процеси в клітинах та тканинах, є білки сімейства Вс1-2 (їх відносять до класу G-білків), які займають центральне місце у регуляції апоптозу. На цей час відомо, що одні білки сімейства Вс1-2 є індукторами апоптозу (Bad, Вах, J3ik, Bid, Bak), інші - його інгібіторами (Вс1-2, Вс1~Х). Про- та антиапоптозні білки здатні об'єднуватися один одним, формуючи гомо- та гетеродимери. Наприклад, при поєднанні інгібітору апоптозу білка Вс1-2 з білком-активатором апоптозу Вах підсумковий ефект, ті. гальмування або активація апоптозу, визначатиметься тим, який білок переважатиме в цьому комплексі.

Апоптоз відіграє велику роль у морфогенезі організму, будучи «інструментом» підтримки гомеостатичного балансу між процесами проліферації та загибелі клітин. Це енергозалежний процес, за допомогою якого видаляють «небажані» та дефектні клітини організму. Причому цей процес реалізується дуже акуратно: утворюються внаслідок апоптотичної загибелі клітин т. зв. "апоптотичні тільця" негайно фагоцитуються без розвитку запалення та пошкодження навколишніх клітин.

Взагалі, програмовану клітинну смерть вивчають кілька десятиліть. Термін «апоптоз» виник 1972 р. Першими дослідниками генетичних і молекулярних механізмів апоптозу були С. Бреннер, Дж. Салстон і Р. Хорвіц (вчені з Кембриджської лабораторії молекулярної біології). У 2002 році вони були удостоєні Нобелівської премії за дослідження програмованої клітинної смерті. До теперішнього часу встановлено, що патогенетично значуща надмірність або недостатність апоптозу може бути патогенетичною основою багатьох захворювань. За порівняно короткий час встановлено основні механізми реалізації апоптозу і регулятори цього процесу.

Механізми розвитку апоптозу

Незважаючи на різноманітність етіологічних факторів, що ініціюють апоптоз, в даний час прийнято виділяти два основні варіанти трансдукції сигналу апоптозу: рецепторно-залежний за участю рецепторів загибелі клітини та мітохондріальний Однак ці шляхи розвитку апоптозу не є суворо паралельними, тобто альтернативними один одному. При сучасних дослідженнях апоптозу виявляють дедалі більше перетинів цих шляхів, напрааленных для досягнення єдиної кінцевої мети цього процесу.

Рецепторно-опосередкований шлях розвитку апоптозу

Рецепторно-опосередкований шлях розвитку апоптозу, як правило, починається із взаємодії специфічних позаклітинних лігандів із рецепторами клітинної загибелі, експресованими на поверхні клітинної мембрани. Рецептори, що сприймають сигнал апоптозу, відносяться до суперродини TNF-рецепторів. Найбільш вивченими рецепторами смерті, для яких описана та визначена роль в апоптозі, є CD95 та TNFRI.

Всі рецептори смерті є трансмембранними білками. Після ліганд-рецепторної взаємодії екстрацеллюдарні домени таких рецепторів передають сигнал інтрацелюлярним доменам рецепторів смерті, в т.ч. адаптер для рецептора CD95 (FADD). Адаптер, асоційований з рецептором смерті, вступає у взаємодію з прокаспазами - поки що не активними попередниками - членами сімейства ініціаторів каспаз. В результаті ланцюжка взаємодії «ліганд-рецептор-прокасп'яза» формуються апоптосоми - агрегати, які забезпечують активацію каспаз.

Мітохондріальний шлях розвитку апоптозу

Мітохондріальний шлях розвитку апоптозу ініціюється пошкодженням мітохондрій, для якого характерно головним чином збільшення проникності внутрішньої мембрани мітохондрій внаслідок утворення в ній величезних часів. Розкриття таких пір можуть викликати різні причини, у тому числі активні форми кисню, включаючи N0, роз'єднання окисного фосфорилювання, збільшення вмісту Са++ в цитоплазмі. Утворення доби в мітохондріях можуть викликати також каспази - представники рецепторно-опосередкованого шляху розвитку апоптозу. Наслідком розкриття пір є набухання мітохондріального матриксу, розрив зовнішньої мембрани мітохондрій та вихід розчинних апоптогенних білків із міжмембранного простору мітохондрій у цитоплазму клітини.

У спектр таких білків входять цитохром, мітохондріальний флавопротеїн AIF (Apoptoxis Inducing Factor) - індуктор апоптозу, прокаспази 2,3 і 9.

Вивільняється з мітохондрій цитохром С спільно з цитоплазматичним фактором APAF-1 (Apoptosis Protease Activating Factor-1 - активуючий фактор апоптотичної протеази-1) утворює конструкцію, що отримала назву апоптосома, яка забезпечує активацію каспази 9 Попередньо яким набуває здатність зв'язувати цитохром С. Аполтосома, що утворилася, активує прокаспазу 3 з утворенням ефекторної каспази 3.

Фловопротеїн AIF, що вивільняється з мітохондрій, є ефектором апоптозу, що діє незалежно від каспаз.

Підсумком програмованої клітинної загибелі незалежно від початкового ініціювання впливають фрагментація ДНК за участю нуклеаз, а також розпад клітини на окремі апоптотичні тільця, обмежені плазматичною мембраною. На зовнішній стороні мембрани експресуються специфічні молекулярні маркери, які розпізнаються фагоцитуючими клітинами. Таким чином, реалізація апоптозу, як правило, забезпечується інтегрованою взаємодією двох основних сигнальних шляхів - рецепторзалежного та мітохондріального.

На сьогоднішній день розроблено кілька десятків методів виявлення та вивчення апоптотичних клітин in vivo та in vitro. Ці методи базуються на якісній чи кількісній оцінці подій, викликаних змінами зовнішньої мембрани клітин, вибірковою фрагментацією ядерної ДНК, змінами структури внутрішньоклітинних компонентів або їх перерозподілом. Для визначення апоптотичних клітин, крім світлової та флуоресцентної мікроскопії, використовують лазерну скануючу та проточну цитометрію, однофотонну емісійну комп'ютерну томографію, магнітно-резонансну томографію, магнітно-резонансну спектроскопію, позитронно-емісійну томографію тощо.

Результати підрахунку за допомогою електронної мікроскопії кількості апоптотично змінених клітин на напівтонкому зрізі тканини, що досліджується, виражають у вигляді так званого індексу апоптозу (АІ), який на сьогоднішній день є «золотим стандартом» оцінки апоптозу:

АІ = Кількість апоптотичних клітин/

Загальна кількість клітин x 100.

Використання різних методик вивчення апоптозу дозволило закономірно виявляти вул'траструктурні дегенеративні зміни кар-дном іонітів у хворих на кардіоміопатію, гіпертрофію серця та хронічну серцеву недостатність. Численними дослідженнями встановлено підвищення інтенсивності апоптотичних процесів у міокарді лівого шлуночка при його хронічному навантаженні в умовах розвитку артеріальної гіпертензії. Збільшення індексу апоптозу виявлено і в міокарді правого шлуночка у разі підвищення гемодинамічного навантаження (переднавантаження обсягом) на серці.

В експериментах з моделюванням артеріальної гіпертензії виявлено виражений позитивний кореляційний зв'язок між ступенем розвитку гіпертрофії міокарда та інтенсивністю апоптозу кардіоміоцитів. Припускають, що фактором, що активує програмовану загибель кардіоміоцитів при гемодинамічному перевантаженні (постнавантаження тиском або переднавантаження об'ємом) серця, є підвищення кінцевого об'єму діастоли в шлуночках, детермінуюче збільшення ступеня розтягування кардіоміоцитів. При розтягуванні стінки шлуночків активізується надходження до кардіоміоцитів іонів Са++, які стимулюють каспазний механізм апоптозу.

Активація апоптозу кардіоміоцитів при артеріальній гіпертензії може бути обумовлена також дією ангіотензину І, утворення якого нерозривно пов'язане зі стимуляцією локальної кардіальної РААС. Ангіотензин II, який був виявлений у тканинах передсердь людини, реалізує свою дію через рецептори типу II. Цей тип рецепторів знаходиться в експресованому стані в ембріональному періоді, але відсутній у постнатальному. Однак при дисфункції міокарда відбувається реекспресія цього типу рецепторів до ангіотензину ІІ. Кардіальний ангіотензин II, крім зазначених вище ефектів, може індукувати апоптотичну загибель кардіоміоцитів. Встановлено, що проапоптогенний ефект ангіотензину-Н може реалізуватися за рахунок його здатності стимулювати продукцію Вах-протеїну (Вс1-2 асоційований Х-протеїн), а також утворення активних форм кисню.

Останнім часом з'явилися роботи, в яких були спроби визначити механізми, що опосередковують взаємозв'язок між ступенем розвитку гіпертрофії міокарда та інтенсивністю апоптозу при експериментальній артеріальній гіпертензії.

Певну роль стимуляції апоптозу кардіоміоцитів грають SMAD-протеїни (SMAD - Similar to Mothers Against Dectapentaplejpc). Це внутрішньоклітинні білки, які опосередковують сигналізацію від TGF-pl рецептора. Припускають, що SMAD-протеїни є факторами переходу від компенсаторного гіпертрофічного зростання до серцевої недостатності.

Висловлюється припущення про те, що апоптотична загибель гіпертрофованих кардіоміоцитів може реалізовуватися за рахунок некаспатних механізмів, опосередкованих, зокрема, апоптозіндуціруюпшм фактором AIF (Apoptosis Inducing Factor); це мітохондріальний флавопротеїк локалізований між внутрішньою та зовнішньою мембранами мітохондрій При деструкції мітохондрій, викликаної активними формами кисню та іонами кальцію, AIF вивільняється з мітохондрій, а потім транстопується в ядро. Механізм апоптогенного ефекту AIF полягає в активації ендонуклеази, що розщеплює ДНК, що маніфестується конденсацією хроматину і фрагментацією ДНК.

У ряді публікацій обговорюється можливість участі анексинового механізму в інтенсифікації апоптозу кардіоміоцитів при гіпертонічному ураженні серця. Анексії А5 (АпхА5) являє собою Са~+ зв'язуючий протеїн, який активується при дії різних апоптотатичних стимулів на кардіоміоцити та інші клітини міокарда. Припускають, що внутрішньоклітинний анексії А5 сприяє реалізації апоптотичних процесів за рахунок впливу на обмін кальцію та стан мітохондрій.

Як загальний фактор, що індукує паралельний розвиток гіпертрофії міокарда та активізацію апоптотичних процесів мітохондріальним шляхом при гемодинамічному перевантаженні лівого шлуночка, може також бути оксидативний стрес.

Представляються дуже цікавими результати дослідження, в якому різні маркери апоптозу, у тому числі Fas, білки сімейста Всl-2, каспази, визначали в міокарді як за його фізіологічної (компенсаторної), так і при патологічній гіпертрофії. Встановлено, що підвищену чутливість до апоптогенних стимулів виявляють лише гіпертрофовані кардіоміоцити. При цьому виявилося, що при патологічній гіпертрофії проапоптозні зміни більш виражені, ніж при фізіологічній.

Незважаючи на те, що в більшості робіт є вказівки на індукцію мітохондріального шляху апоптогенної сигнальної трансдукції та її зв'язок із формуванням гіпертрофії міокарда, у деяких експериментах вивчали і рецепторно-опосередкований механізм. Зокрема, in vitro було встановлено, що при штучній стимуляції Fas-рецепторів мишачих кардіоміоцитів розвивалася їхня виражена гіпертрофія, пов'язана з інактивацією глікогенсинтази кінази 3-р (GSK3-0).

Інтенсивність апоптозу кардіоміоцитів пов'язують також з адренергічною регуляцією. Так, фармакологічні дослідження in vitro підтвердили, що при стимуляції Pj-адренорецепторів (активація цих рецепторів призводить до підвищення хвилинного об'єму кровообігу за рахунок збільшення ударного об'єму та тахікардії) індукується апоптоз кардіоміоцитів, ймовірно пов'язаний з цАМФ та кальцієвим механізмом. Активація р2-адренорецепторів, навпаки, викликає антиапоптозний ефект. Вважають, що p-адренергічна індукція апоптозу реалізується мітохондріальним сигнальним шляхом, оскільки при зниженні проникності мембрани мітохондрій або активності каспаз зменшується інтенсивність апопшгічних процесів, викликаних стимуляцією p-адренорецепторів.

Прозапальні цитокіни TNF-a, IL-ip, IL-6 разом із активними формами кисню здатні порушувати внутрішньоклітинний обмін Са++. При цьому вважають, що прозапальні цитокіни більшою мірою відповідальні за індукцію апоптозу за допомогою їх з'єднання з мембранними рецепторами (рецепторно-опосередкований шлях), тоді як кальцієве навантаження переважно викликає некротичні зміни за рахунок пошкодження мітохондрій (мітохондріальний шлях). Підвищений рівень TNF-a корелює з тяжкістю хронічної серцевої недостатності. На сьогоднішній день встановлено, що протизапальні цитокіни IL-10, TGF-p пригнічують апоптогенну активність TNF-a в кардіоміоцитах. Аналогічну властивість виявляє фактор SOCS-1 (Suppressor of Cytokine Signaling-1 - супресор цитокінового сигналу -1). Механізм дії останнього реалізується через модуляцію МАРК (Mitogen-Activate Protein Kinase – мітогенакговані протеїнкінази).

Останнім часом активно вивчають механізми програмованої клітинної загибелі кардіоміоцитів та інших клітинних елементів міокарда за різних кардіодистрофічних процесів, насамперед при кардіоміопатіях. Щодо ролі апоптозу в динаміці морфологічних змін міокарда при дилатаційній кардіоміопатії думки різних авторів розходяться. У ранніх роботах зазначали, що немає чітких доказів участі апоптотичних механізмів у розвитку цієї форми патології. Однак використання сучасних тонких методів детекції маркерів апоптозу дозволило іншим дослідникам встановити протилежне.

Апоптоз кардіоміоцитів при гіпертрофічній та рестриктивній кардіоміопатіях на сьогоднішній день залишається маловивченим.

Посилення апоптозу кардіоміоцитів спостерігають за багатьох поширених форм патології серця. Особливу увагу при цій приділяють вивченню процесу апоптозу в патогенезі хронічної серцевої недостатності. Поки немає достатньо переконливих доказів впливу апоптозу на скорочувальну активність міокарда. Крім того, на сьогоднішній день недостатньо вивчені незавершені та оборотні форми апоптозу, про існування яких свідчить ціла низка сучасних наукових досліджень.

Разом з тим, на цей час вже з'явилися фармакологічні засоби, здатні ефективно інгібувати апоптоз кардіоміоцитів, індукований різними стимулами. Ці засоби переважно застосовують у експериментальних умовах. Накопичено також певний досвід їх використання у клінічній практиці. Виходячи із сучасних уявлень про механізми розвитку апоптозу, основу патогенетичної терапії ушкоджень міокарда, детермінованих активацією апоптозу, становить блокада (інгібування) даного процесу на різних стадіях його розвитку (індукція, трансдукція, транслокація, реалізація апоптогенної генетичної програми).

Антиапоптогенний ефект може бути досягнутий за допомогою впливу на рівні рецепторів. В експериментах, наприклад, було встановлено, що IL-33 попереджає апоптоз кардіоміоцитів та покращує функцію серця у мишей з інфарктом міокарда. IL-33 взаємодіє з мембранним рецептором ST2. ST2 (Growth Slimulation expressed gene t стимулюючий фактор росту, що експресується геном 2) - це член сімейства рецепторів IL-1, відноситься до найновіших маркерів, що використовуються для прогнозування ризику розвитку несприятливих наслідків та летальності пацієнтів з підтвердженим діагнозом серцевої недостатності. ST2 експресується у серці у відповідь на патологічні зміни, спричинені хронічними захворюваннями серця та/або його гострими ушкодженнями, та відображає процеси ремоделювання шлуночків серця.

У клінічній практиці прикладом препарату, що має властивість інгібувати апопотоз на рівні рецепторів, може бути карведилол. Застосування цього офіційного препарату суттєво знижує рівень смертності хворих на серцеву недостатність. У спектрі ефектів карведилолу виділяють його антиапоптотичну дію, яка ґрунтується на пригніченні експресії міокардіальних Fas-рецепторів та інгібуванні SAPK (Stress-Activated Protein Kinase)-протеїнкінази (цей фермент активується в умовах розвитку стресу).

Сприятливий антиапоптогенний ефект може бути досягнутий інгібіторами каспаз. В експериментальних умовах, наприклад, доведено, що використання хлорометилкетону, здатного пригнічувати активацію каскаду каспаз, скорочує зону інфаркту піддослідних кроликів приблизно на 30%.

Інший приклад – результати дослідження впливу на апоптоз кардіоміоцитів міцелярної форми ізосорбіду динітрату – екзогенного донора оксиду азоту. У дослідах на щурах з модельованою коронарною недостатністю, що зазнали стресорного впливу, введення цього препарату призводило до зниження кількості «апоптотичних» клітин, зменшення зони ішемії порівняно зі стресовою групою тварин. Автори цього дослідження припускають, що механізми придушення апоптозу пов'язані зі складною взаємодією між білками теплового шоку, антиапоптотичними білками Вс1-2, різними каспазами та оксидом азоту. Ці дослідники вважають, що міцелярна форма ізосорбіду динітрату може бути рекомендована для застосування в клінічній практиці з метою пригнічення апоптозу кардіоміоцитів в умовах розвитку коронарної хвороби та серцевої недостатності.

Зовсім недавно було встановлено, що деякі гормональні препарати мають цитопропгекторний ефект, заснований на антиапоптозній активності щодо кардіоміоцитів. Зокрема, виявлено здатність прогестерону зменшувати апоптотичну загибель кардіоміоцитів за рахунок активації експресії генів, що кодують синтез Bcl-xL. Антиапоптогенну активність виявляють кортикостероїди (гідрокортизон, кортизон, альдостерон).

Іншим можливим варіантом фармакологічного пригнічення апоптозу кардіоміоцитів є блокада експресії популярного гена р53.

На закінчення відзначимо, що апоптоз - це еволюційно-вироблений типовий патологічний процес, який при ремоделюванні міокарда може мати як захисно-пристосувальне, так і патогенне значення, залежно від конкретних умов його розвитку. Активація апоптотичної загибелі кардіоміоцитів відбувається при багатьох формах порушення насосної функції серця, нерідко граючи роль основного патогенетичного фактора, наприклад, при хронічній серцевій недостатності.

До теперішнього часу на молекулярному рівні розшифровано цілу низку механізмів апоптотичної загибелі кардіоміоцитів.

CAD (caspase activated DNase) на фрагменти розміром, кратним 180-200 нуклеотидів. В результаті апоптозу відбувається утворення апоптичних телець-мембранних везикул, що містять цілісні органели та фрагменти ядерного хроматину. Ці тільця поглинаються сусідніми клітинами або макрофагами внаслідок фагоцитозу. Так як позаклітинний матрикс не уражається клітинними ферментами навіть при великій кількості апоптозних клітин, запалення не спостерігається.

Процес апоптозу є необхідним для фізіологічного регулювання кількості клітин організму, для знищення старих клітин, для формування лімфоцитів, які не є реактивними до своїх антигенів (аутоантигенів), для осіннього опадіння листя рослин, для цитотоксичної дії Т-лімфоцитів кілерів, для ембрі зникнення шкірних перетинок між пальцями у ембріонів птахів) та інших.

1. Значення апоптозу

Апоптоз – невід'ємна частина життєдіяльності більшості багатоклітинних організмів. Особливо важливу роль він відіграє у процесах розвитку. Наприклад кінцівки чотирилапих закладаються як лопатоподібні вирости, а формування пальців відбувається завдяки загибелі клітин між ними. Також підлягають апоптозу більше не потрібні клітини, таким чином, зокрема, руйнується хвіст у пуголовків при метаморфозі. У нервовій тканині хребетних під час ембріонального розвитку більше половини нейронів гинуть шляхом апоптозу відразу після утворення.

Також апоптоз є частиною системи контролю за якістю клітин, він дозволяє руйнувати ті з них, які неправильно розташовані, пошкоджені, нефункціональні або потенційно небезпечні для організму. Прикладом можуть бути і B-лімфоцити, які гинуть, якщо не несуть корисних антиген-специфічних рецепторів або несуть автореактивні. Шляхом апоптозу також вмирає більшість лімфоцитів атківованих при інфекції після його подолання.

У дорослих організмів одночасне регулювання проліферації клітин та апоптозу дозволяє підтримувати стали розміри цілої особини та її окремих органів. Наприклад, після застосування препарату фенобарбітал, що стимулює проліферацію гепатоцитів, у щурів збільшується печінка. Однак відразу після припинення дії цієї речовини всі зайві клітини підлягають апоптозу, в результаті чого розмір печінки повертається до нормального.

Також апоптоз відбувається, коли клітина "відчуває" велику кількість внутрішніх ушкоджень, які вона не може репарувати. Наприклад, у разі пошкодження ДНК клітина може трансформуватися в ракову, щоб цього не сталося вона, за нормальних умов, "кінчає життя самогубством". Також гине шляхом апоптозу велика кількість клітин, інфікованих вірусами.

2. Маркери апоптичних клітин

Маркери апоптозу

Виявлення фрагментації ДНК в апоптичних клітинах методом TUNEL Препарат тканини печінки миші, ядро апоптичної клітини має коричневе забарвлення, оптичну мікроскопію.

Виявлення фрагментації ДНК у апоптичних клітинах за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. Зліва: ДНК виділеної з апоптичних клітин - видно "драбинку ДНК"; посередині: маркери; справа: контрольний зразок ДНК із необроблених клітин. Клітинна лінія H4IIE (гепатома щурів), індуктор апоптозу - паракват, візуалізація за допомогою етидій броміду.

Зверху: виявлення конденсації та фрагментації хроматину шляхом зафарбовування флуоресцентним барвником (Hoechst 34580). Посередині: виявлення транслокації фосфадиділсерину у зовнішній листок плазмалемми шляхом зафарбовування анексіном V. Знизу: Мікрофотографія апоптичних клітин у світлому полі. Клітинна лінія - Jurkat, індуктор апоптозу - TRAIL, конфокальноїі світопильна оптична мікроскопія.

Клітини, що гинуть шляхом апоптозу, можна розпізнати за низкою морфологічних ознак. Вони стають меншими і більш щільними (пікноз), округляються і втрачають псевдоподію, в них руйнується цитоскелет, розпадається ядерна мембрана, хроматин конденсується і фрагментується. На поверхні клітин з'являється велика кількість бульбашок, якщо клітини досить великі, то вони розпадаються на оточені мембранами фрагменти – апоптичні тільця.

В апоптичних клітинах окрім морфологічних відбувається також велика кількість біохімічних змін. Зокрема ДНК розрізається спеціальними нуклеазами в лінкерних ділянках між нуклеосомами на фрагменти рівної довжини. Тому при поділі всієї ДНК апоптичної клітини за допомогою електрофорезу можна спостерігати характерну "драбинку". Інший метод виявлення фрагментації ДНК - мітки її вільних кінців за допомогою методу TUNEL ( T erminal deoxynucleotidyl transferase d U TP n ick e nd l abeling ) .

Зміни зазнає також плазматична мембрана апоптичних клітин. За нормальних умов негативно заряджений фосфоліпід фосфатидилсерин міститься тільки в її внутрішньому (поверненому до цитозолю) шарі, проте під час апоптозу він "перескакує" у зовнішній листок. Ця молекула служить сигналом "з'їж мене" для ближніх фагоцитів. Фосфатидилсерін-індуковане поглинання апоптичних клітин, на відміну від інших типів фагоцитозу, не призводить до виділення медіаторів запалення. Описана зміна плазмалемме лежить в основі ще одного методу виявлення клітин, що гинуть шляхом апоптозу - забарвлення анексином V, специфічно зв'язується з фосфатидилсерином.

3. Каспаз – медіатори апоптозу

Клітинні системи, що забезпечують проходження апоптозу, аналогічні у всіх тварин, центральне місце в них посідає сім'я білків каспаз. Каспаз - це протеази, що мають в активному центрі залишок цистеїну, і розрізають свої субстрати за специфічним залишком аспарагінової кислоти (звідси назва: cвід cysteineі aspвід aspartic acid). Каспази синтезуються в клітині у вигляді неактивних прокаспаз, які можуть ставати субстратами для інших, вже активованих каспаз, що ріжуть їх в одному або двох місцях залишку аспартату. Два утворені фрагменти – більший та менший – з'єднуються між собою, формуючи димер, що асоціює з таким самим диммером. Сформований таким чином тетрамер є активною протеазою, що може розрізати білки-субстрати. Крім ділянок, що відповідають більшій та меншій субодиницях, прокаспази іноді також містять інгібіторні продомени, які деградують після відщеплення.

Внаслідок розщеплення та активації одних каспаз іншими формується протеалітичний каскад, який суттєво посилює сигнал та робить апоптоз з певного моменту незворотним процесом. Ті прокаспази, які починають цей каскад, називаються ініціаторним, а їхні субстрати - ефекторними. Після атківації ефекторні каспази можуть розщеплювати інші ефекторні прокаспази або білки-мішені. До мішеней ефекторних каспаз, що руйнуються під час апоптозу, належать зокрема білки ядерної ламіни, розщелення яких призводить до розпаду цієї структури. Також деградує білок, при нормальних умовах пригнічує CAD ендонуклеази, внаслідок цього починається фрагментація ДНК. Розщеплюються каспаз і білки цитоскелета та міжклітинної адгезії, внаслідок чого апоптичні клітини округляються та від'єднуються від сусідніх клітин, і таким чином стають легше мішенню для фагоцитів.

Набір каспаз, необхідний для проходження апоптозу, залежить від типу тканини та шляху, яким активується клітинна смерть. Наприклад, у мишей при "виключенні" гена, що кодують ефекторні каспази-3, апоптоз не відбувається в мозку, проте нормально протікає в інших тканинах.

Гени прокаспаз активні у здорових клітинах, а отже білки необхідні для протікання апоптозу, що постійно присутні, потрібна лише їх активація для запуску клітинного суїциду. До складу ініціаторних прокаспаз входить довгий продомен, що містить CARD ( caspase recruitment domain , Домен залучення каспаз). CARD дозволяє ініціаторним прокаспазам приєднуватися до адаптерних білків утворюючи активаційні комплекси, коли клітина отримує сигнал, що стимулює апоптоз. В активаційних комплексах кілька молекул прокаспаз виявляються безпосередньо поблизу один одного, чого достатньо для переходу в активний стан, після чого вони розрізають один одного.

Два краще вивчені сигнальні шляхи активації каскаду каспаз в клітинах ссавців називаються зовнішнім і внутрішнім (мітохондріальним), кожен з них використовує власні ініціаторні прокаспази.

4. Шляхи активації апоптозу

4.1. Зовнішній шлях

Клітина може отримувати сигнал, що індукує апоптоз, ззовні, наприклад, цитотоксичних лімфоцитів. У такому разі активується так званий зовнішній шлях ( extrinsic pathway), що починається з рецепторів смерті. Рецептори смерті - це трансмембранні білки, що належать до сімейства рецепторів фактора некрозу пухлин (ФНП), наприклад, сам рецептор ФНП і рецептор смерті Fas. Вони формують гомотримери, в яких кожен мономер має позаклітинний ліганд-зв'язковий домен, трансмембранний домен і цитоплазматичний домен смерті, через адаптерні білки залучає та активує прокаспази.

Ліганди рецепторів смерті також гомотримерами. Вони споріднені між собою і належать до сімейства сигнальних молекул фактора некрозу пухлин. Наприклад, цитотоксичні лімфоцити несуть на своїй поверхні ліганди Fas, які можуть приєднуватися до рецепторів смерті Fas на плазмалемі клітин-мішеней. У такому разі внутрішньоклітинні домени цих рецепторів з'єднуються з адаптерним білком ( FADD, Fas-associated death domain ), а ті у свою чергу залучають ініціаторні прокаспази 8 та/або 10. Внаслідок цієї серії подій формується сигнальний комплекс, що індукує смерть, - DISC ( death inducing signaling complex ). Після активації в цьому комплексі ініціаторні каспази розрізають ефекторні прокаспази і запускають апоптичний каскад.

Багато клітин синтезують молекули, певною мірою захищають їхню відмінність від активації зовнішнього шляху апоптозу. Прикладом такого захисту може бути експресія так званих рецепторів-приманок ( decoy receptors), що мають позаклітинні домени зв'язування лігандів, проте не цитоплазматичних доменів сметри, а отже не можуть запускати апоптозу і конкурують із звичайними рецепторами смерті за ліганди. Клітини також можуть продукувати білки, що блокують зовнішній шлях апоптозу, наприклад FLIP, схожий структурою прокаспаз 8 і 10, проте не протеалітичної активності. Він пригнічує зв'язування ініціаторних прокаспаз із комплексом DISC.

4.2. Внутрішній шлях

Апоптосома

Апоптоз також може запускатися зсередини клітини, наприклад, у разі її травмування, пошкодження ДНК, нестачі кисню, поживних речовин або позаклітинних сигналів виживання. У хребетних цей сигнальний шлях називається внутрішнім ( intrinsic pathway) Або мітохондріальною, ключовою подією в ньому є вивільнення певних молекул з міжмембранного простору мітохондрій. До таких молекул зокрема належить цитхром c, що за звичайних умів входити до електронно-транспортної цепочки мітохондрій, проте у цитоплазмі виконує іншу функцію - приєднується до адаптерного білка Apaf ( apoptotic protease activating factor-l ), викликаючи його олігомеризації в колесоподібну семичленну структуру, яка називається апоптосома. Апоптосома приваблює та активує ініціаторну прокаспазу-9, яка потім може активувати ініціаторну прокаспазу.

У деяких клітинах зовнішній шлях апоптозу повинен активувати внутрішній для того, щоб ефективно знищити клітину. Внутрішній шлях суворо регулюється білками сім'ї Bcl-2.

4.2.1. Регуляція внутрішньої дороги білками сім'ї Bcl-2

До сімейства Bcl-2 відносяться еволюційно-консервативні білки, головною функцією яких є регуляція вивільнення цитохрому c та інших молекул з міжмебранного простору мітохондрій. Серед них є про-апоптичні та анти-апоптичні молекули, які можуть взаємодіяти між собою в різних комбінаціях, пригнічуючи один одного, баланс між їхньою активністю та визначати долю клітини.

Зараз відомо близько 20 білків із цієї сім'ї, всі вони містять хоча б один із чотирьох альфа-спіральних доменів гомології Bcl2, званих BH1-4 ( bcl2 homology). Антиапоптичні білки сім'ї Bcl2 містять усі чотири домени, до них відносяться сам Bcl-2, а також Bcl-X L, Bcl-w, Mcl-1 та A1. Проапоптичні білки поділяються на дві групи, члени першої з яких містять три BH-домени (BH1-3), зокрема Bak, Bax і Bok (останній експресується тільки в тканинах репродуктивних органів). Найбільш численною серед родини Bcl-2 є друга група проапоптичних білків, які містять лише домен BH3 (BH3-only), до неї відносяться Bim, Bid, Bad, Bik/Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa, Puma.

За нормальних умов (тобто коли клітина не проходить апоптозу) антиапоптичні білки, такі як Bcl-2 та Bcl-X L, зв'язуються з проапоптичними білками BH123 (Bax та Bak) та не дозволяють їм полімеризуватися у зовнішній мембрані мітохондрій утворюючи пори. В результаті дії певного апоптичного стимулу в клітині активуються або починають синтезуватися проапоптичні білки, що містять лише домен BH3. Вони у свою чергу пригнічують антиапоптичні білки, знімаючи пригнічуючу дію на Bak і Bax, або безпосередньо взаємодіють з останніми та сприяють їх олігомеризації та утворенню пір. Внаслідок пермеабілізації зовнішньої мембрани в цитозоль потрапляє цитохром c, а також інші медіатори апоптозу, такі як AIF (англ. apoptosis inducing factor ).

Ініціація апоптозу може відбуватися за допомогою зовнішніх чи внутрішньоклітинних факторів. Наприклад, в результаті гіпоксії, гіпероксії, субнекротичного ураження хімічними або фізичними агентами, перехресного зв'язування відповідних рецепторів, порушення сигналів клітинного циклу, видалення факторів росту та метаболізму тощо. -залежний сигнальний шлях за участю рецепторів загибелі клітини та мітохондріальний шлях.

Рецептор-залежний сигнальний шлях

Схема передачі сигналів апоптозу за допомогою рецепторів смерті CD95, TNFR1 та DR3

Процес апоптозу часто починається із взаємодії специфічних позаклітинних лігандів із рецепторами клітинної загибелі, експресованими на поверхні клітинної мембрани. Рецептори, що сприймають сигнал апоптозу, відносяться до суперродини TNF-рецепторів. Найбільш вивченими рецепторами смерті, для яких описана та визначена роль в апоптозі, є CD95 та TNFR1. До додаткових належать CARI, DR3, DR4 та DR5.

Всі рецептори смерті є трансмембранними білками, що характеризуються наявністю загальної послідовності з 80 амінокислот в цитоплазматичному домені. Дана послідовність називається доменом смерті та є необхідною для трансдукції сигналу апоптозу. Позаклітинні ділянки рецепторів смерті взаємодіють із тримерами лігандів. Тримери лігандів внаслідок взаємодії тримеризують рецептори смерті. Активований таким чином рецептор взаємодіє з відповідним внутрішньоклітинним адаптером. Для рецептора CD95 адаптером є FADD. Для рецепторів TNFR1 та DR3 адаптером є TRADD.

Адаптер, асоційований з рецептором смерті, вступає у взаємодію з ефекторами поки неактивними попередниками протеаз з сімейства ініціюють каспаз з прокаспазами. В результаті ланцюжка взаємодії «Ліганд-рецептор-адаптер-ефектор» формуються агрегати, в яких відбувається активація каспаз. Ці агрегати називаються апоптосомами, апоптозними шаперонами або сигнальними комплексами, що індукують смерть. Прикладом апоптосоми може бути комплекс FasL-Fas-FADD-прокаспаза-8, у якому активується каспаза-8.

Рецептори смерті, адаптери та ефектори взаємодіють між собою подібними структурою доменами: DD, DED, CARD. DD бере участь у взаємодії рецептора Fas з адаптером FADD та у взаємодії рецепторів TNFR1 або DR3 з адаптером TRADD. За допомогою домену DED здійснюється взаємодія адаптера FADD з прокаспаз -8 і -10. Домен CARD бере участь у взаємодії адаптера RAIDD з прокаспазою-2.

За допомогою рецепторів смерті можуть бути активовані три ініціюючі каспази: −2; −8 та −10. Активовані ініціюючі каспази далі беруть участь у активації ефекторних каспаз.

Мітохондріальний сигнальний шлях

Мітохондріальний сигнальний шлях апоптозу реалізується внаслідок виходу апоптогенних білків із міжмембранного простору мітохондрій у цитоплазму клітини. Вивільнення апоптогенних білків, ймовірно, може здійснюватися двома шляхами: за рахунок розриву мітохондріальної мембрани або шляхом відкриття високопроникних каналів на зовнішній мембрані мітохондрій.

Модель утворення апоптосоми «Цитохром з Apaf-1 CARD прокаспаза-9». Активована таким чином каспаза-9 рекрутує прокаспазу-3, яка активізується до каспази-3

Розрив зовнішньої мембрани мітохондрій пояснюється збільшенням обсягу мітохондріального матриксу. Цей процес пов'язують з розкриттям пір мітохондріальної мембрани, що призводить до зниження мембранного потенціалу та високоамплітудного набухання мітохондрій внаслідок осмотичного дисбалансу. Пори діаметром 2,6-2,9 нм здатні пропускати низькомолекулярні речовини масою до 1,5 кДа. Розкриття пір стимулюють такі фактори: неорганічний фосфат; каспази; SH-реагенти; виснаження клітин відновленим глутатіоном; утворення активних форм кисню; роз'єднання окисного фосфорилювання протонофорними сполуками; збільшення вмісту Ca у цитоплазмі; вплив цераміду; виснаження мітохондріального пулу АТФ та ін.

Як альтернативний шлях виходу апоптогенних білків з міжмембранного простору мітохондрій розглядається варіант утворення білкового каналу у зовнішній мітохондріальній мембрані. Так чи інакше, в цитоплазму вивільняються: цитохром з білок з молекулярною масою 15 кДа; прокаспази −2, −3 та −9; AIF - флавопротеїн з молекулярною масою 57 кДа.

Цитохром c у цитоплазмі клітини бере участь у формуванні апоптосоми разом із білком Apaf-1. Попередньо, Apaf-1 зазнає конформаційних змін у результаті реакції, що протікає з витратою енергії АТФ. Передбачається, що трансформований Apaf-1 набуває здатності зв'язувати цитохром c. До того ж відкривається доступ CARD-домену Apaf-1 для прокаспази-9. В результаті відбувається олігомеризація не менше 8 субодиниць трансформованого білка Apaf-1 за участю цитохрому c і прокаспази-9. Так утворюється апоптосома, що активує каспазу-9. Зріла каспаза-9 зв'язує та активує прокаспазу-3 з утворенням ефекторної каспази-3. Мітохондрій флавопротеїн AIF, що вивільняється з міжмембранного простору, є ефектором апоптозу, що діє незалежно від каспаз.

Інші шляхи індукції апоптозу

Варто зазначити, що реалізація апоптозу може відбуватися в результаті комбінованої дії двох основних сигнальних шляхів - рецептор-залежного та мітохондріального. Крім цього, існує низка менш поширених механізмів ініціації апоптозу. Наприклад, рахунок активації прокаспази-12, локалізованої в эндоплазматическом ретикулумі. Вивільнення та активація прокаспази-12 при цьому обумовлені порушеннями внутрішньоклітинного гомеостазу іонів кальцію. Активація апоптозу може бути пов'язана з порушенням адгезії клітин.

Як ще один фактор індукції апоптозу розглядається атака інфікованих клітин цитотоксичними Т-лімфоцитами, які, крім активації Fas-рецептора, здатні секретувати перфорин поблизу мембрани зараженої клітини. Перфорин, полімеризуючись, утворює трансмембранні канали, через які всередину клітини надходять лімфотоксин-альфа та суміш серинових протеаз. Далі гранзим B активує каспазу-3 та запускається каспазний каскад.

Можлива ініціація клітинної смерті при вивільненні лізосомальних протеаз - катепсинів. Наприклад, каспаза-8 викликає вихід із лізосом активного катепсину B, який потім розщеплює регуляторний білок Bid. В результаті утворюється активний t-Bid білок, що активує в свою чергу проапоптозний білок Bax.

Загальна схема «класичного» апоптозу ссавців

Ефективна фаза

Протягом ефекторної фази різні шляхи, що ініціюють, конвертуються в один загальний шлях апоптозу. Як правило, відбувається активація каскаду білків-ефекторів і білків-модуляторів, що їх регулюють. Основними ефекторами апоптозу є каспази. У процесі активації вони запускають каспазний каскад: складно переплетені ланцюжки взаємодій ініціюючих та ефекторних каспаз.

Каспазний каскад

Каспази є цистеїновими протеазами, які розщеплюють амінокислотні послідовності після залишку аспарагінової кислоти. Каспази утворюються за рахунок активації прокаспаз, у складі яких виділяють 3 домени: регуляторний N-кінцевий домен, велику та малу субодиниці. Активація відбувається шляхом протеолітичного процесингу: всі три домени розщеплюються, відокремлюється продомен, а велика і мала субодиниці, що залишилися, асоціюються, утворюючи гетеродимер. Два гетеродимери надалі формують тетрамер повноцінну каспазу з двома каталітичними ділянками.

Каспази виявлено у більшості живих організмів. У ссавців ідентифіковано 13 каспаз. Частина в апоптозі не бере участі. Інші каспази, які беруть участь в апоптозі, поділяють на ініціаторні та ефекторні. Ініціаторні каспази активують ефекторні каспази, які у свою чергу провокують і безпосередньо беруть участь у трансформації клітини. У результаті морфологічні та біохімічні зміни призводять до загибелі клітини на кшталт апоптозу.

Одна з основних функцій ефекторних каспаз полягає в прямому та опосередкованому руйнуванні клітинних структур. Гідроліз піддаються білки ядерної ламіни, руйнується цитоскелет, розщеплюються білки, що регулюють клітинну адгезію. Іншою важливою функцією ефекторних каспаз є інактивація білків, які блокують апоптоз. Зокрема, розщеплюється інгібітор DFF, що перешкоджає активації апоптозної ДНКази CAD. Руйнують і антиапоптозні білки сімейства Bcl-2. Нарешті, внаслідок дії ефекторних каспаз відбувається дисоціація регуляторних та ефекторних доменів, що беруть участь у репарації ДНК, мРНК-сплайсингу та ДНК-реплікації.

Додаткові ефектори апоптозу

Крім каспаз, існують і інші ефектори апоптозу. Наприклад, флавопротеїн AIF, що вивільняється з міжмембранного простору мітохондрій, діє незалежно від каспаз шляху. Потрапляючи в клітинне ядро, AIF викликає конденсацію хроматину та активує ендонуклеази, які беруть участь у фрагментації ДНК. На підставі експериментальних даних встановлено, що апоптоз, що протікає у присутності AIF, не запобігає інгібітору каспаз. Як ефектори апоптозу також розглядаються кальпаїни - представники сімейства цитозольних Ca-активованих цистеїнових протеаз. Їхня роль в апоптозі поки що слабко охарактеризована.

Деградаційна фаза

Підсумком програмованої клітинної загибелі незалежно від початкового впливу, що ініціює, є деградація клітини шляхом фрагментації на окремі апоптотичні тільця, обмежені плазматичною мембраною. Фрагменти загиблої клітини зазвичай швидко фагоцитуються макрофагами чи сусідніми клітинами, минаючи розвиток запальної реакції.

Морфологічні зміни

Умовно деградацію клітини, що гине, можна розділити на три послідовні фази: вивільнення, блеббінга і конденсації. Деградація більшості клітин починається з вивільнення прикріплень позаклітинного матриксу та реорганізації фокальної адгезії. Усередині гинуть клітини деполімеризуються мікротрубочки цитоскелета. Внутрішньоклітинні актинові мікрофіламенти реорганізуються у зв'язані з мембраною периферійні кільцеві пучки. У результаті клітина набуває округлої форми. Наступна за вивільненням стадія блеббінгу характеризується скороченням периферійних актинових кілець. Внаслідок скорочень клітинна мембрана утворює здуття, клітина як би «кипить». Процес блебінгу енергозалежний і вимагає великої кількості АТФ. Фаза блебінгу в нормальних умовах завершується приблизно за годину. У результаті клітина фрагментується на дрібні апоптотичні тіла, або повністю конденсується, округляючись і зменшуючись у розмірах.

Біохімічні зміни

На молекулярному рівні одним із наслідків апоптозу є фрагментація ДНК за участю нуклеаз. Спочатку утворюються великі фрагменти з 30 000-700 000 пар основ, які надалі розщеплюються в міжнуклеосомній ділянці на відрізки по 180-190 пар основ або кратні цим величинам. Фрагментація ДНК є характерною, але не обов'язковою ознакою апоптозу, тому що існують спостереження, у ході яких процес фрагментації ядра протікав без супутньої фрагментації ДНК.

Ще одним суттєвим наслідком апоптозу є експресія на зовнішній стороні плазматичної мембрани специфічних молекулярних маркерів, що розпізнаються фагоцитуючими клітинами: тромбоспондину; фосфатидилсерину та інших фосфоліпідів, що містять фосфосерин.

При реалізації апоптозуумовно можна назвати чотири стадії.

Ініціація -> Програмування -> Реалізація програми -> Видалення загиблої клітини

Стадії апоптозу Стадія ініціації

На цій стадії інформаційні сигнали рецептуються клітиною. Патогенний агент або сам є сигналом, або зумовлює генерацію сигналу в клітині і його проведення до внутрішньоклітинних регуляторних структур і молекул.

Ініціюючі апоптозстимули можуть бути трансмембранними чи внутрішньоклітинними.

Трансмембранні сигналиподіляють на негативні, позитивні та змішані.

- Негативні сигнали: відсутність або припинення впливу на клітину факторів росту, цитокінів, що регулюють поділ та дозрівання клітини, а також гормонів, що контролюють розвиток клітин. У нормі дія названих груп БАВ на мембранні рецептори забезпечує придушення програми загибелі клітині нормальну їхню життєдіяльність. Навпаки, їхня відсутність чи зниження ефектів «звільняє» програму апоптозу. Так, для нормальної життєдіяльності низки нейронів потрібна постійна наявність нейротрофічних факторів. Їхнє усунення або зниження ефектів на нервові клітини може призвести до включення програми смерті нейрона. - Позитивні сигнали в результаті генерують запуск програми апоптозу. Так, зв'язування ПІБ (FasL) з його мембранним рецептором CD95 (Fas) активує програму смерті клітини. - Змішані сигналиє комбінацією впливів сигналів першої та другої груп. Так, апоптозу піддаються лімфоцити, що простимульовані мітогеном, але не проконтактували з чужорідним Аг. Гинуть і ті лімфоцити, на які впливав Аг, але не отримали інших сигналів, наприклад, мітогенного або HLA.

Серед внутрішньоклітинних стимулів апоптозузареєстровані надлишок Н+, вільні радикали ліпідів та інших речовин, підвищена температура, внутрішньоклітинні віруси та гормони, що реалізують свій ефект через ядерні рецептори (наприклад, глюкокортикоїди).

Апоптоз: стадія ініціації.

Стадія програмування

Стадія програмування(контролю та інтеграції процесів апоптозу) представлена на малюнку.

На цій стадії спеціалізовані білки або реалізують сигнал до апоптозушляхом активації виконавчої програми (її ефекторами є цистеїнові протеази - каспази та ендонуклеази), або блокують потенційно летальний сигнал.

Виділяють два (що не виключають один одного) варіанти реалізації стадій програмування: 1) шляхом прямої активації ефекторних каспаз та ендонуклеаз (минаючи геном клітини) та 2) опосередкованої через геном передачі сигналу на ефекторні каспази та ендонуклеази.

Пряма передача сигналуздійснюється через адапторні білки, гранзими та цитохром С.

Адапторні білки. Як адапторний білок виступає, наприклад, каспаза-8. Так реалізують свою дію цитокіни Т-лімфоцитів-кілерів щодо чужорідних клітин, ФНП та інші ліганди CD95.

Цитохром С. Виділяючись із мітохондрій, цитохром С разом із білком Apaf-1 і каспазою-9 формує комплекс активації (апоптосому) ефекторних каспаз. Каспаза-8 та каспаза-9 активують ефекторні каспази (наприклад, каспазу-3), які беруть участь у протеолізі білків.

Гранзими. Ці протеази виділяють цитотоксичні Т-лімфоцити, протеази проникають у клітини-мішені через цитоплазматичні пори, попередньо сформовані перфоринами. Гранзими активують аспартатспецифічні цистеїнові протеази клітини-мішені, що піддається апоптозу.

Пряма передача сигналуспостерігається зазвичай у без'ядерних клітинах, наприклад, у еритроцитах.

Апоптоз: стадія програмування.

Опосередкована передача сигналупередбачає репресію генів, що кодують інгібітори апоптозу, та активацію генів, що кодують промотори апоптозу.

Білки-інгібітори апоптозу(наприклад, продукти експресії антиапоптозних генів Bcl-2, Bcl-XL) блокують апоптоз (наприклад шляхом зменшення проникності мембран мітохондрій, тим самим зменшуючи ймовірність виходу в цитозоль одного з пускових факторів апоптозу - цитохрому С).

Білки-промотори апоптозу(наприклад, білки, синтез яких контролюється генами Bad, Box, антионкогенами Rb або /т53) активують ефекторні кас-пази та ендонуклеази.

Сподобалася стаття? Поділіться їй

Роздрукувати статтю