Що точніше пцр чи піф. Діагностика хламідіозу. Імуноморфологічні методи. Коли та як здавати аналізи на хламідії

Chlamydia trachomatis- Внутрішньоклітинний мікроорганізм, що викликає ряд захворювань сечостатевої системи та очей. Варіанти (серовари) Chlamydia trachomatis поділяють на "очні", "генітальні" та "хламідії венеричної лімфогранульоми". "Очні" викликають трахому - інфекція, що вражає кон'юнктиву і рогівку ока і призводить до сліпоти. "Генітальні" хламідії викликають урогенітальний хламідіоз - гостре або хронічне захворювання, що призводить до безпліддя. "Хламідії венеричної лімфогранульоми" вражають статеві органи та лімфотичні вузли, можлива генералізована форма інфекції.

Урогенітальний хламідіоз характеризується ураженням сечостатевого тракту, зазвичай, з малосимптомним перебігом. Часто ця інфекція нагадує гонорею: свербіж, виділення, біль при сечовипусканні, але ці симптоми при хламідіозі негаразд виражені і потім розвивається інфекція в органах малого тазу, що призводить до непрохідності маткових труб і насіннєвих проток.

Даний аналіз дозволяє визначити наявність Chlamydia trachomatis у мазку.

Метод

При проведенні реакція прямої імунофлюоресценції досліджуваний матеріал обробляють стандартними сироватками імунними, з флюорохромними мітками. За наявності бактерій у матеріалі антитіла сироватки з ними зв'язуються та під люмінісцентним мікроскопом бактерії світяться у вигляді зеленої облямівки.

ПІФ є методом експрес-діагностики виявлення хламідіозу.

Референсні значення – норма
(Chlamydia trachomatis (хламідіоз), антиген (ПІФ), мазок)

Інформація, що стосується референсних значень показників, а також сам склад показників, що входять до аналізу, може дещо відрізнятися залежно від лабораторії!

Норма:

У нормі бактерії не виявляються.

Показання

1. Скринінг хламідіозу

2. Визначення збудника, що спричинив захворювання

3. Безпліддя

Підвищення значень (позитивний результат)

Урогенітальний хламідіоз

Де здати аналіз

Знайдіть цей аналіз в іншому населеному пункті

Ведення. Урогенітальна хламідійна інфекція (УГХІ) Chlamydiatrachomatisє найчастішою ІПСШ та протікає у чоловіків зазвичай у формі уретриту, а у жінок у формі гнійно-серозного цервіциту. Діагностика УХІ базується на методах лабораторного дослідження, оскільки клінічні прояви мають неспецифічний характер, і у значній кількості випадків інфекція протікає приховано у субклінічній формі, маніфестуючи вже на стадії розвитку ускладнень.

Найбільш ефективними методами діагностики УДХІ в даний час у всьому світі вважаються методи ампліфікації нуклеїнових кислот (МАНК), які мають високу чутливість, специфічність і можливість автоматизації, завдяки чому зростає об'єктивність оцінки результатів дослідження та можливість аналізу великої кількості клінічних зразків. У нашій країні серед МАНК найбільшого поширення набув метод ПЛР, на основі якого кількома виробниками випускаються комерційні тест-системи. Крім того, вперше у зарубіжній та вітчизняній практиці у ФГУН ЦНДІ Епідеміології Росспоживнагляду була розроблена та пройшла Державну реєстрацію тест-система на основі реакції транскрипційної ампліфікації НАСБА з детекцією в реальному часі (Рег. удост. ). Однак, поряд з МАНК, як і раніше, особливо в Російській Федерації, широко застосовується метод прямої імунофлуоресценції (ПІФ), який відносно простий у виконанні і не вимагає спеціального дорогого обладнання. Недоліком методу є невисока діагностична чутливість та специфічність, які значною мірою залежать від якості отримання клінічного матеріалу та досвіду лабораторного персоналу.

Сьогодні замість регламентованого алгоритму лабораторного обстеження при діагностиці УДХІ пропонується перелік існуючих методів із зазначенням їх діагностичних характеристик [Козлова В.І., Пухнер А.Ф., 2003; Соколовський Є.В., Савічева А.М., 2006; Дерматовенерологія 2007. Клінічні рекомендації]. У зв'язку з цим деякі вітчизняні керівництва [Макарова О.В., Алешкіна В.А., Савченко Т.М., 2007] рекомендують для збільшення достовірності результатів лабораторного дослідження на УДХІ використовувати одночасно два методи, не враховуючи, що методи, що відрізняються за аналітичним характеристикам, можуть призводити до неспівпадаючих результатів і тільки збільшувати труднощі остаточного діагнозу.

Метоюпроведеного дослідження стало вивчення об'єктивності результатів при діагностиці УДХІ з використанням методів ПЛР та ПІФ.

матеріали та методи. Матеріалом для дослідження служили зіскрібки з уретри від 132 чоловіків, які проходили клініко-лабораторне обстеження на базі ММА ім. І.М.Сєченова. Від кожного пацієнта було отримано не менше двох зразків, один з яких наносився на предметне скло для подальшого дослідження методом ПІФ, а інший зміщувався в транспортне середовище для подальшого дослідження МАНК. Для діагностики методом ПІФ використовували комерційну тест-систему «ХлаМоноскрин» (ЗАТ «Ніармедік ПЛЮС», Росія). Для виявлення ДНК C.trachomatisвикористовували тест-систему «Амплісенс Chlamydia trachomatis- FRT» на основі ПЛР «в реальному часі», а для виявлення РНК C.trachomatisтест-систему на основі НАСБА "в реальному часі". Реакції ампліфікації ПЛР та НАСБА з детекцією флуоресцентного сигналу в реальному часі проводили у приладах RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралія)

Результати. Позитивні результати виявлення C.trachomatisметодом ПІФ було отримано у 44 пацієнтів, а методом ПЛР – у 32 пацієнтів. Однак збіг результатів ПІФ та ПЛР був лише у 8 випадках. Таблиця 1.

Для підтвердження результатів дослідження методом ПІФ 30 скла після дослідження одним фахівцем було повторно досліджено іншим незалежним фахівцем. Для підтвердження результатів ПЛР відповідні клінічні зразки було повторно розморожено та досліджено на наявність РНК C.trachomatisметодом НАСБА. Результати представлені у Таблиці 2.

Таблиця 2.

"-" - виявлено, "+" - не виявлено, "сумн." - результат сумнівний

Як видно з таблиці, результати обох МАНК збіглися в 100% випадках, у той час як при використанні методу ПІФ результати отримані першим фахівцем (ПІФ1) значною мірою були інтерпретовані інакше другим фахівцем (ПІФ2). Незважаючи на те, що в 4-х випадках позитивні результати ПІФ, зазначені обома фахівцями, не підтвердилися результатами МАНК, дані збіги через загальну велику кількість розбіжностей в оцінках результатів ПІФ виглядають швидше випадковими. Не можна виключити, що в ряді випадків розбіжність результатів методів ПЛР і ПІФ є наслідком помилок при отриманні клінічного матеріалу для дослідження другим методом, проте набагато важливіше те, що отримана в процесі дослідження методом ПІФ цитологічна картина інтерпретується різними фахівцями.

Суб'єктивність методу ПІФ відзначено давно. У 1986 р. Колегія Патологів Америки ініціювала комплексну оцінку використання методу ПІФ для діагностики хламідійної інфекції, що проводиться різними лабораторіями США. У звітній доповіді за результатами за 1986-1992рр. вказується на значні розбіжності у виконанні процедури фіксації, обліку кількості елементарних частинок, необхідні позитивного висновку про наявність інфекції, які у роботі антитіл. Зниження порога значимості нижче 10 флуоресціюючих включень у поле зору призводило до зниження специфічності тесту. Автори звіту наголошують, що значною мірою результати залежали від підготовленості, досвіду та тривалості роботи лабораторного персоналу.

Метод прямої імунофлюоресценції є способом безпосереднього виявлення антигенів хламідій. Люмінесцентна мікроскопія визначає хламідійні включення як утворення в клітинах епітелію з жовто-зеленою або зеленою флюоресценцією на тлі коричнево-жовтогарячої цитоплазми клітин. Включення мають гомогенну, зернисту або змішану структуру.

Пряма імунофлюоресценція застосовується у випадках: гострої фази захворювання; хронічної фази захворювання; встановлення етіології інфекційних хронічних процесів урогенітального тракту; вагітності, обтяженої акушерським анамнезом; безпліддя невизначеного генезу.

Мал. 1.Пряма імунофлюоресценція. Прямий метод передбачає використання помічених флюоресцентним барвником AT до Аг, що цікавить; AT взаємодіють з Аг у місцях їх локалізації, що дозволяє візуалізувати мітка.

Інформативна здатність прямої імунофлюоресценції полягає у виявленні не тільки корпускулярних, а й розчинних антигенів хламідій. Даний метод працює незалежно від можливих змін тинкторіальних особливостей мікроорганізмів при захворюванні та лікуванні. Метод прямої імунофлюоресценції є основним скринінговим методом діагностування урогенітального хламідіозу. Його специфічність та чутливість становить 65-90% або 85-90% у випадках застосування моноклональних антитіл. Оцінюючи результати, слід мати на увазі, що як позитивні результати тесту оцінюється виключно показник флюоресценції внутрішньоклітинних включень, якщо використовувалися поліклональні антихламідійні антитіла.

У разі використання моноклональних антитіл результати вважаються позитивними, якщо в полі зору присутні 10 ЕТ (елементарних тілець) або хоча б одне внутрішньоклітинне включення. Підготовка зішкрібних препаратів така сама, як і при цитоскопічних дослідженнях. Моноклональні антитіла можна відрізнити одне від одного за незмінністю форм ЕТ, яскравості флюоресценції і рівнем специфічності. При діагностуванні описаним методом хламідій використовують люмінесцентний мікроскоп.

Фахівці сходяться на думці, що метод прямої імунофлюоресценції відповідає вимогам високої специфічності та чутливості, проте серйозно зростають критерії компетенції лабораторних працівників. Досить високий рівень експертної оцінки методом прямої імунофлюоресценції доступним буває далеко не завжди, через що усереднений показник його чутливості недостатньо високий. У випадках визначення малої кількості ЕТ метод не гарантує необхідної чутливості, що призводить іноді до помилково-негативних результатів.

До непрямого методу імунофлюоресценції вдаються у випадках, коли відсутній ФІТЦ-кон'югат антихламідійних антитіл. У таких ситуаціях підготовлений з клінічних проб тим же способом, що і для прямої імунофлюоресценції, препарат спочатку обробляють антихламідійними антитілами, які одержують методом імунізації хламідіями кроликів, мишей, овець або інших тварин, а потім - специфічною для даної, імунізованої хламідіями, тварини другої сироти. . Антитіла останньої сироватки є кон'югованими з ФІТЦ. Специфічність та показання до використання описаного методу можна порівняти з методом прямої імунофлюоресценції.

Говорячи про методи імуноферментного аналізу, слід зазначити, що вони засновані на виявленні розчинного антигену хламідії у наданих на дослідження пробах. У клінічній практиці використовуються переважно набори реагентів, утворені методом твердофазних ІФА-аналізів для встановлення антигенів хламідій. Ампліфікації досягають, використовуючи методи полімерної кон'югації, наслідком є ​​фіксація, коли для кожної пов'язаної ділянки антигену визначається полімерна група з високомолекулярної складової.

Внаслідок застосування методу фермент-ампліфікації позитивна проба набуває жовто-жовтогарячого забарвлення, інтенсивність якого пропорційна чисельності антигену хламідії. Точні результати дослідження визначаються за допомогою обчислювальної техніки.

Хламідійна інфекція викликається Chlamydia trachomatis- грамнегативною бактерією, що належить сімейству Chlamydiaceae. Вид Chlamydia trachomatisвключає різні серовари, що викликають окремі нозологічні форми захворювань. Сероварова A, B, C викликають трахому, L1, L2, L3 - венеричну лімфогранулему. Найбільшого поширення у країнах Європи, Південної та Північної Америки та в Росії набули серовари DK, які передаються при статевих контактах і викликають урогенітальну хламідійну інфекцію (УХІ). Можлива перинатальна передача з розвитком новонароджених кон'юнктивіту або пневмонії. C.trachomatisмає унікальний серед інших збудників ІПСШ життєвий цикл. Інфікування епітеліальних клітин відбувається метаболічно неактивними формами хламідій – елементарними тільцями (ЕТ). Усередині клітин ЕТ трансформуються в ретикулярні тільця (РТ) – метаболічно активні форми, що діляться. Накопичення всередині епітеліальних клітин нових генерацій РТ та їх паралельна трансформація назад у ЕТ виснажує ресурси клітин господаря, призводячи їх до загибелі, вивільнення ЕТ та нового циклу інфікування. Неускладнена хламідійна інфекція протікає у чоловіків найчастіше у формі уретриту, у жінок – у формі слизово-гнійного цервіциту. Симптоми та прояви УХІ неспецифічні, для встановлення діагнозу УХІ необхідні лабораторні дослідження для виявлення збудника або його маркерів. Значна частина випадків УХІ – від 40 до 60% протікає у безсимптомній чи малосимптомній формі та проявляється вже на стадії ускладнень. Основними ускладненнями УХІ є: епідидиміт, ендометрит, сальпінгіт, сальпінгоофорит, позаматкова вагітність, трубна безплідність, хвороба Рейтера.

Показання до призначення лабораторних досліджень.У чоловіків:наявність симптомів та клінічних проявів уретриту, епідидиміту або епідидимоорхіту; в осіб, які практикують аногенітальні контакти – проктиту; при фізикальному огляді – наявність виділень із уретри.

У жінок:наявність симптомів запального процесу у нижніх відділах урогенітального тракту та органах малого тазу, болі в низу живота, патологічні виділення з піхви; наявність слизових або слизово-гнійних виділень із цервікального каналу, порушення менструального циклу, болючість при статевих контактах; підготовка до хірургічного втручання органів малого таза; підготовка до вагітності, обтяжений акушерсько-гінекологічний анамнез, пов'язаний із інфекційною патологією.

В осіб обох статейбез симптомів та ознак запального процесу урогенітального тракту: наявність перерахованих вище симптомів та ознак або встановлена ​​УХІ у статевого партнера; у віковій групі до 25 років – численні статеві партнери або статеві контакти з новим статевим партнером без бар'єрної контрацепції.

Диференційна діагностика.Гонорея, урогенітальний трихомоніаз, інфекція, спричинена M.genitalium.

Етіологічна діагностика включаєвізуальне виявлення C.trachomatis, виділення культури C.trachomatis, виявлення АГ, ДНК та РНК C.trachomatisта АТ до мікроорганізму.

Матеріал для досліджень

• Мазки/зіскоби зі слизових оболонок цервікального каналу та уретри жінок – мікроскопічні дослідження, культуральні дослідження, виявлення артеріальної гіпертензії, виявлення ДНК, РНК;
• мазки/зіскоби зі слизової оболонки піхви, мазки (зіскоби) зі слизової оболонки прямої кишки - виявлення ДНК, РНК;
• мазки/зіскоби з кон'юнктиви очей – культуральні дослідження, виявлення ДНК;
• сеча (у чоловіків) – виявлення ДНК;
• сироватка крові – виявлення АТ.

Порівняльна характеристика методів лабораторної діагностикиДля візуального виявлення C.trachomatisможливе застосування світлової чи люмінесцентної мікроскопії. При застосуванні світлової мікроскопії використовується фіксований препарат біологічного матеріалу, забарвлений по Романівському-Гімзі, в якому виявляють змінені клітини циліндричного епітелію, що містять ЕТ та РТ. C.trachomatis, що отримали назву тілець Гальберштедтера Провачека Діагностична чутливість дослідження вбирається у 10%. Поширеним прийомом виявлення хламідій є визначення артеріальної гіпертензії мікроорганізму методом ПІФ. За допомогою люмінесцентної мікроскопії в препараті, обробленому флуоресцентно-міченими АТ до хламідій, характерним світінням виявляються ЕТ C.trachomatis. Мікроскопічні дослідження, насамперед ПІФ, досить прості у виконанні і не вимагає дорогого обладнання, проте дуже вимогливі до якості отриманого біологічного матеріалу, техніки нанесення препарату на скло та специфічності АТ. Матеріал для виконання ПІФ повинен містити достатню кількість клітин циліндричного епітелію, його одержують із цервікального каналу (за показаннями – з уретри) та у чоловіків із передньої уретри. Для інтерпретації результату необхідна наявність у препараті не менше 5–10 клітин циліндричного епітелію (відображає якість отримання біоматеріалу) у полі зору та не менше 10 флуоресціюючих ЕТ. Діагностична чутливість методу ПІФ варіює у межах – від 10 до 65%. Максимальна чутливість та специфічність методу відзначена у пацієнтів з клінічними проявами інфекції та високим бактеріальним навантаженням, мінімальна – при безсимптомних або малосимптомних формах.

Для культивування C.trachomatisв умовах in vitro використовуються чутливі до мікроорганізму еукаріотичні клітинні лінії – HeLa, McCoy, L-929, у яких відбувається розвиток хламідій. У процесі дослідження ЕТ, що містяться в біологічному матеріалі, інфікують чутливі клітини культури та розмножуються у них. Через 48-72 години після зараження в культурі накопичуються клітини, що містять включення - РТ і ЕТ, що розмножилися. Результат культурального дослідження візуально оцінюється при використанні методу ПІФ за допомогою люмінесцентної мікроскопії. Культуральний метод тривалий час розглядався як «золотий стандарт» діагностики, оскільки мав більшу чутливість у порівнянні з методом світлової мікроскопії та імунологічними методами при практично 100% специфічності. Однак ефективність методу значною мірою залежить від стану використовуваної клітинної лінії – її життєздатності та сприйнятливості до інфікування хламідіями, на які можуть негативно впливати продукти життєдіяльності, що містяться в біологічному матеріалі, антибіотики, місцеві бактерицидні препарати, хімічні компоненти та урогенітальних. Іншою важливою умовою є збереження життєздатності самих хламідій у досліджуваному біологічному матеріалі. Діагностична чутливість методу з урахуванням зазначених факторів варіює від 40 до 85%.

Для виявлення АГ C.trachomatisза кордоном було розроблено ряд тестів на основі ІФА. Діагностична чутливість виявлення артеріальної гіпертензії C.trachomatisзнаходиться в межах 55-78%. Зазначені тести набули широкого поширення у зарубіжній лабораторній практиці, проте в РФ не застосовуються.

Виявлення АТ класів IgA, IgM та IgG до АГ C.trachomatisу крові здійснюється методами МІФ чи ІФА. Метод МІФ розглядається як "золотий стандарт" визначення АТ до АГ хламідій, він дозволяє проводити серотипування. При визначенні АТ IgM МІФ має більшу чутливість, ніж ІФА, що важливо при діагностиці хламідійної інфекції у новонароджених. Однак дослідження досить трудомістке і вимагає дорогих високоочищених АГ C.trachomatisТому метод ІФА набув найбільшого поширення в міжнародній та вітчизняній практиці. Виявлення АТ IgA може свідчити про наявність гострої або загострення хронічної інфекції. Для правильної оцінки результатів визначення АТ за допомогою ІФА необхідно враховувати декілька важливих умов. При неускладненій УХІ основну роль відіграє місцева ланка імунної системи за участю специфічних та неспецифічних факторів. На терміни появи та рівень циркулюючих у крові АТ впливають індивідуальна імунологічна реактивність організму, терміни інфікування, тривалість інфекції, повторні випадки інфікування, рівень бактеріального навантаження та цілий ряд інших факторів. Тому АТ у крові можуть з'являтися у строк від кількох тижнів до кількох місяців після інфікування. Елімінація АТ може відбуватися протягом декількох років або зберігатися практично на все життя.

Для виявлення ДНК C.trachomatisв РФ використовують переважно ПЛР з різними варіантами детекції продуктів реакції та метод виявлення РНК C.trachomatisна основі НАСБА. Діагностична чутливість методу ПЛР для діагностики УХІ знаходиться в межах від 90% до 98%, специфічність досягає 96-98%. Діагностична чутливість методу НАСБА сягає 98%, діагностична специфічність – до 100%.

Показання для застосування різних лабораторних досліджень.Мікроскопічне дослідження препаратів із забарвленням по Романовському-Гімзі нині не використовується і не рекомендується для діагностики УХІ. У той же час, усім пацієнтам із симптомами та клінічними проявами урогенітальної інфекції показано мікроскопічне дослідження з забарвленням за Грамом для встановлення лабораторних ознак запалення (підвищений вміст ПМЯЛ).

Застосування методу ПІФ є доцільним як метод швидкої діагностики за наявності у пацієнтів виражених проявів інфекційно-запального процесу в урогенітальному тракті за умови дотримання всіх вимог отримання біологічного матеріалу. Метод не підходить для скринінгу, діагностики хронічних форм хламідійної інфекції, контролю лікування та дослідження зразків сечі та слизової оболонки піхви, прямої кишки, ротоглотки.

З урахуванням того, що для проведення культурального дослідження необхідна технологія ведення еукаріотичних клітинних ліній та відповідні для цього лабораторні умови, застосування методу в рутинній лабораторній практиці обмежене. Метод насамперед має значення у наукових дослідженнях, коли потрібно виділити живий збудник щодо його подальшого вивчення.

Визначення АТ до C.trachomatisможе бути використане для епідеміологічних досліджень, з метою інтегральної оцінки частки осіб у популяції, що контактувала з C.trachomatis. У клінічній практиці визначення АТ показано при ретроспективному аналізі можливої ​​хламідійної етіології при безплідді, тривалих хронічних запальних процесах урогенітального тракту. Однак і в цьому випадку позитивні результати виявлення АТ повинні розглядатись у контексті інших клінічних, анамнестичних та лабораторних даних.

В даний час виявлення ДНК методом ПЛР вважаються основою лабораторної діагностики УХІ. Дослідження показано і контролю результатів лікування. При використанні методу ПЛР з урахуванням швидкості елімінації ДНК C.trachomatisКонтроль лікування необхідно проводити не раніше 3-4 тижнів. РНК збудника є більш раннім маркером відповіді на терапію, тому за допомогою методу НАСБА можна оцінювати ефективність лікування через 1-2 тижні після закінчення курсу.

Особливості інтерпретації результатів лабораторних досліджень.Результати, отримані методом ПІФ, рекомендується підтверджувати культуральним або молекулярно-біологічними методами.

Позитивні результати культурального дослідження не потребують додаткового підтвердження та означають наявність інфекції. Негативний результат означає відсутність збудника, так і може свідчити про неоптимальні умови для його культивування.

При виявленні ДНК C.trachomatisу пацієнтів з клінічною симптоматикою урогенітальної інфекції або наявності факторів, що сприяють інфікуванню, додаткового дослідження не потрібне, діагноз урогенітальної інфекції вважається встановленим. У пацієнтів, у яких виявлено ДНК C.trachomatis, але відсутні суб'єктивні та об'єктивні ознаки інфекційно-запального захворювання та фактори ризику, для підтвердження діагнозу рекомендується провести дослідження для виявлення РНК C.trachomatisметодом НАСБА. Наявність ДНК та РНК патогену є об'єктивною лабораторною ознакою інфекції.

Оцінюючи результатів виявлення АТ слід враховувати, що й наявність чи відсутність не відбиває наявність чи відсутність інфекції у час.